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Introducción general a la apoptosis
Eventos celulares del proceso de apoptosis
 

 

>> CAMBIOS EN LA MEMBRANA PLASMÁTICA

>> CAMBIOS EN LA MITOCONDRIA

>> CAMBIOS NUCLEARES

>> ELIMINACIÓN DE LA CÉLULA APOPTÓTICA

 

 

CAMBIOS EN LA MEMBRANA PLASMÁTICA

La membrana plasmática de la célula es uno de los lugares donde se hacen más evidentes los efectos de toda la serie de modificaciones bioquímicas que constituyen la apoptosis. Esto hace que la célula adquiera un aspecto típicamente apoptótico caracterizado por la disminución de tamaño, el aislamiento respecto de las células que la limitan (en el caso en que sea adherente) y el redondeamiento de su forma. Se generan también unas estructuras a modo de pequeñas evaginaciones esféricas surgidas a partir de la membrana, que se denominan blebs y que confieren a la célula un aspecto "boiling" (hirviente) al inicio del proceso y "pop-corn like" (forma de palomita de maíz) en los últimos estadios, cuando a los blebs se les han unido los cuerpos apoptóticos de tamaño mucho mayor y con contenido nuclear.

En las células apoptóticas se producen también cambios en la simetría de los fosfolípidos de membrana. Esto no se puede apreciar con la simple observación de la célula al microscopio, pero se puede detectar mediante técnicas de fluorescencia y, de hecho, resultan muy útiles a la hora de identificar poblaciones de células apoptóticas. La bicapa lipídica que forma la membrana plasmática de la célula tiene una composición y orientación muy determinada. Su distribución asimétrica se describió por primera vez hace 20 años (234/Bretcher, Nature 1972) y parece que este concepto se ha hecho extensivo a todos los tipos celulares de organismos eucariotas. De los fosfolípidos que forman la bicapa, los que contienen colina, esfingomielina y fosfatidilcolina, están orientados al exterior, mientras que la mayoría de los aminofosfolípidos, fosfatidilserina y fosfatidiletanolamina, están orientados hacia el interior. Esta orientación de la membrana no es un hecho estático, sino que es fruto de una dinámica en la que continuamente los fosfolípidos se mueven cruzando la membrana en ambas direcciones hasta conseguir el equilibrio que garantice la correcta arquitectura. En la estabilidad de esta intervienen interacciones lípido-lípido, lípido-proteína y proteína-proteína, así como la acción de tres enzimas: flipasa, flopasa y scramblasa, que median los movimientos de los fosfolípidos en una forma ATP y Calcio dependiente (234). La enzima flipasa transporta rápidamente los aminofosfolípidos (PS y PE) desde la membrana externa hacia la interna de una forma dependiente de ATP. La flopasa, otra enzima dependiente de ATP, transporta lentamente y de forma no especifica fosfolípidos de la membrana interna a la externa. Por último, la scramblasa se activa con un incremento del calcio intracelular y, de forma muy rápida, induce una aleatorización de la distribución de fosfolípidos.

Durante la apoptosis, ocurre una perdida de la asimetría de la membrana y por tanto una externalización de PS como uno de los eventos más precoces (67). Existe muy poca información sobre el mecanismo de esta alteración aunque puede que, por una parte, el aumento intracelular de Ca++ y, por otra, las alteraciones en los niveles de PIP2 que se dan durante la apoptosis ocasione un desacople de las enzimas encargadas de mantener la asimetría. Este evento es muy importante para el proceso general de la apoptosis ya que "marca" a las células para su posterior fagocitosis como se verá a continuación.

La otra alteración de la membrana asociada a apoptosis que es la formación de blebs, presenta también una gran cantidad de incógnitas en lo que se refiere a su mecanismo de formación. Es bien conocido que durante la apoptosis se produce una reorganización del citoesqueleto por la proteolisis de muchos de sus componentes y esto puede dar lugar a la formación de estas estructuras, de cuyo posible papel fisiológico trata parte de este trabajo. .

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CAMBIOS EN LA MITOCONDRIA

Como se ha mostrado en apartados anteriores, la mitocondria juega un papel muy importante dentro del proceso de apoptosis. Su función amplificadora de la señal, iniciada por las caspasas, asegura la culminación del proceso incluso ante la existencia de un reducido número de moléculas de proenzima actuando como unidades iniciadoras. Así mismo aporta a la ruta ejecutora de la apoptosis un sitio de regulación mediante las proteínas de la familia Bcl-2 (56bis). Finalmente, en ausencia de caspasas, como se ha demostrado en sistemas tratados con inhibidores de estas, es capaz de mediar por si sola una forma de muerte celular mucho mas lenta y de características atípicas cuya relevancia fisiológica se está estudiando (83).

Debido a esta fuerte implicación en el proceso, la mitocondria es uno de los orgánulos celulares que sufren numerosos cambios en su funcionamiento a lo largo de este. Estos cambios en su función no se corresponden con cambios morfológicos ya que la mitocondria mantiene su apariencia intacta durante prácticamente todo el proceso, a diferencia de lo que ocurre en la necrosis.

A nivel molecular, en la mitocondria se disparan mecanismos propios del programa de apoptosis, además de darse una serie de disfunciones en los procesos bioquímicos llevados a cabo en este orgánulo que pueden, por si mismos a largo plazo, conducir a la célula a la muerte. Estos mecanismos y disfunciones son:

-Se produce un desacople en la cadena de transporte de electrones así como una detención del metabolismo energético (56/13). Esta alteración se ha observado en apoptosis de timocitos producida por radiación g y en la apoptosis vía CD95. La ceramida, un segundo mensajero implicado en la señalización de apoptosis, provoca la detención de la cadena en un punto determinado, según se ha podido comprobar tanto en células como en mitocondria aislada (56/12). Como consecuencia de esto, se produce una caída en la producción de ATP, pero esto ocurre a largo plazo y no parece estar implicado en la inducción de apoptosis.

-Producción de especies reactivas de oxigeno. Dentro de la cadena de transporte electrónico se estima que entre un 1 y un 5% de los electrones se pierden participando principalmente en la formación de iones superoxido O2-. Al perder eficiencia la cadena de transporte durante la apoptosis, se incrementa la formación de estos radicales libres (). Aunque la tardía formación de estas especies y el normal desarrollo de la muerte celular en condiciones de anaerobiosis cuestionan su necesidad dentro del proceso (56/29 o 30), no existen aún base suficientemente consolidadas como para excluirlos de el.

-Liberación de citocromo c. Una gran variedad de agentes pro-apoptóticos inducen en la mitocondria la liberación de citocromo c. Esta molécula, cuya liberación es independiente de caspasas en la mayoría de los sistemas estudiados (hay que hacer la excepción de la liberación inducida por CD95) es una pieza imprescindible en el apoptosoma formado por Apaf-1 y procaspasa-9, y le lleva a su procesamiento hasta dar lugar a caspasa-9 activa. La liberación de citocromo c en respuesta a estímulos pro-apoptóticos se inhibe por la presencia de Bcl-2 (63).

-Fallo en el mantenimiento del potencial transmembrana. El potencial mitocondrial transmembrana proporciona una distribución asimétrica de protones y otros iones en ambas caras de la membrana interna de la mitocondria, dando lugar a un gradiente tanto químico como eléctrico. Durante la apoptosis se ha observado una ruptura de este potencial como rasgo muy temprano. La causa de esta reducción del potencial transmembrana se produce por la apertura de un gran canal llamado poro de transición de permeabilidad (PT) mitocondrial (321bis). Este poro está formado por proteínas de la membrana interna, como el translocador de nucleotido adenina (ANT)y de la membrana externa, como la porina o canal aniónico voltaje dependiente (VDAC). Los componentes de ambas membranas se acoplan entre sí constituyendo un punto de contacto entre ambas membranas a través del cual pueden pasar moléculas de peso = 1,5 KDa. Su función fisiológica, según está en estudio, es permitir la liberación de Calcio al citoplasma y la entrada de proteínas importantes para mantener el potencial transmembrana hacia la matriz mitocondrial, todo esto mediante breves pulsos de apertura. El hecho de que algunos estímulos inhibidores de apoptosis actúan sobre el poro, impidiendo su apertura, hace pensar que pueda tener un papel en el proceso de apoptosis. El lugar del poro PT dentro del programa de ejecución de la apoptosis parece estar "downstream", tanto de la liberación de citocromo c como de la activación de las caspasas (14). En cambio, tanto las caspasas como la proteína Bax si parecen facilitar su apertura permanente (321bis), lo que induciría una nueva liberación de citocromo c y de un factor pro-apoptótico mitocondrial (AIF) que a su vez inducirían activación de caspasas (363bis). Esto sitúa al poro PT como lugar de amplificación de la señal de apoptosis. Independientemente de estos efectos, la apertura del poro PT puede dar lugar a una desregulación del volumen de la mitocondria por hiperosmolaridad en la matriz. Esto la llevaría a expandirse hasta romper la membrana externa con la consiguiente liberación del contenido del espacio intermembrana al citosol.

-Formación de poros por las proteínas de la familia Bcl-2 (56bis). Como se expuso en el apartado anterior, la mayoría de los mecanismos apoptóticos que tienen lugar en la mitocondria están regulados por el equilibrio entre los miembros de la familia Bcl-2. Uno de los mecanismos de regulación de esta familia se basa en la formación de poros en la membrana. Por eso, a todas las alteraciones adquiridas por la mitocondria enumeradas hasta ahora, hay que añadir la acción reguladora de estas proteínas.

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CAMBIOS NUCLEARES

El aspecto del núcleo de una célula apoptótica se convierte en lo más característico de esta. Aunque existen variaciones entre los distintos tipos celulares, en general se produce un aumento en la densidad de la cromatina que comienza formando parches alrededor de la envuelta nuclear y terminan dando lugar a una o varias esferas densas en las últimas etapas. Los cambios iniciales se acompañan de una reducción del núcleo. Esta alteración en la cromatina es fruto de la ruptura de la lámina nuclear, estructura que se encuentra bajo la envuelta nuclear, y que participa en su estabilidad (55/17). Además de estos cambios morfológicos, en el núcleo celular se produce durante la apoptosis, la fragmentación del ADN en una escalera de subunidades regulares que resultan del corte al azar entre los nucleosomas, Llegan a sumarse hasta un millón de cortes dando como consecuencia una situación en la que la transcripción se para, ya que no existe forma de ser reparada. Se conoce muy poco sobre el papel que este fenómeno puede jugar dentro del proceso global de la apoptosis.

La ruptura del ADN es llevada a cabo por una endonucleasa que se activa vía caspasas. Esta endonucleasa fue primero descrita en ratón y se la denominó CAD (caspase-activated dexyribonuclease) (58bis). Esta enzima se encuentra normalmente en el citoplasma de forma inactiva, por efecto del inhibidor ICAD que posee sitios de corte por caspasa-3. Durante el proceso de apoptosis, ICAD es degradado por la caspasa-3 y esto libera y permite la activación de la nucleasa CAD, que realiza su función sobre el núcleo de la célula. En humano existe un sistema homólogo al descrito en ratón (69). Existe una proteína humana, DFF45 (DNA fragmentation factor 45), que presenta una secuencia significativamente similar a la de ICAD y que media también fragmentación del ADN en núcleos cuando se produce activación de la caspasa-3. De esta forma, se supone que DFF45 actúa en humanos sobre una nucleasa similar a CAD inhibiéndola igual que ocurre en ratón. Aunque los efectos de la endonucleasa sobre el ADN celular sean tan drásticos, estudios realizados induciendo apoptosis en células con un inhibidor ICAD mutante resistente a caspasas, demuestran que la célula muere por apoptosis en ausencia de fragmentación del ADN. Esta muerte se traduce en ruptura de sustratos en el citoplasma, alteraciones típicas en la membrana plasmática, en la integridad de la mitocondria etc. Todo esto conduce a la muerte de la célula que mantiene su ADN integro, aunque la cromatina si presenta las alteraciones típicas de apoptosis, probablemente por la acción de caspasas sobre proteínas nucleares como son poli (ADP-ribosa) polimerasa (PARP) o lámina nuclear (68 o 70). Este hecho permite replantear la degradación del ADN en el proceso de apoptosis, no como medio de destrucción de la célula (que llega a morir igualmente en ausencia de fragmentación del ADN) sino como parte del proceso de limpieza de las células muertas, facilitando su fagocitosis o previniendo que el ADN integro pueda transformar a la célula fagocítica.

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ELIMINACIÓN DE LA CÉLULA APOPTÓTICA

En el proceso de apoptosis, tan importante es que la muerte sea rápida, efectiva y sometida a buenos procesos de regulación como que, una vez muerta, la célula sea convenientemente retirada. De esta manera se evita su ruptura y el vertido de su contenido al medio, lo que daría lugar a una respuesta inflamatoria indeseable. Estudios realizados en c. elegans describen la existencia de 7 genes implicados en el aclaramiento de las células apoptóticas, lo que demuestra la importancia que este proceso tiene en la apoptosis (525). En general, existen dos estrategias para este proceso: a) en tejidos con bajos indices de apoptosis, la fagocitosis es ejercida por células vecinas; b) en ciertos tejidos con altas tesas de apoptosis, existen células "profesionales" (generalmente macrófagos) que hacen esta función. Uno de los puntos más importantes en el estudio de este tema es la descripción de los mecanismos de reconocimiento de la célula apoptótica por parte de los fagocitos o las células vecinas encargadas de su eliminación (301). Existen ya varios de estos mecanismos identificados. Estos incluyen tanto sistemas de reconocimiento por parte de los fagocitos, como sistemas de señalización de su estado por parte de las células apoptóticas. El primer mecanismo descrito implica a uno de los sistemas de interacción célula-célula más familiares: los carbohidratos de superficie de una célula se unen a las lectinas de otra célula. Este sistema fue considerado a partir de la observación de que al añadir un azúcar, reconocida por determinada lectina de la superficie celular, como es N acetil glucosamina, se reduce en un 50% respecto al control, la unión de macrófagos peritoneales de ratón a timocitos apoptóticos, sin afectar su unión basal a timocitos no apoptóticos (301/23). Esta acción se demostró que era específica de determinadas lectinas, ya que solo algunos azucares tenían propiedades inhibidoras. A partir de estos datos se estableció que la apoptosis provocaba cambios en los carbohidratos de la superficie celular que lo hacían reconocibles por algunas lectinas. Para confirmar esta hipótesis, experimentos de microelectroforesis celular demostraron que existía una perdida en la superficie celular de cargas negativas (301/24) y todos estos datos en conjunto permitieron confeccionar el siguiente modelo:

La perdida de residuos terminales de ácido siálico de las cadenas laterales de las glicoproteinas por parte de las células apoptóticas, expone residuos normalmente enmascarados por ellas, que interaccionan con las lectinas de la superficie de macrófagos.

El segundo mecanismo se describió a partir de estudios de inhibición dependiente de carga eléctrica, del reconocimiento de células apoptóticas (301/27). Estos hicieron suponer la presencia de una estructura en la superficie de estas células, capaz de interaccionar con los fagocitos. Esta estructura no presentaba carácter proteico, ya que su acción no se inhibía por proteasas ni por inhibidores de su síntesis. A partir de los estudios de inhibición, se identificó también un posible receptor presente en los fagocitos, la integrina a4b3 a la que se atribuían previamente solo funciones de adhesión a matriz. Trabajos posteriores confirmaron el papel de esta molécula en diferentes sistemas experimentales. En la interacción de esta proteína con la célula apoptótica interviene una molécula puente, la trombospondina, que es secretada y sintetizada por los macrófagos y sirve de puente al unirse al complejo formado por a4b3 y CD36 en el fagocito y a una estructura aún por determinar en la célula apoptótica (301/34).

El tercer mecanismo de reconocimiento responde al evento que ocurre en la membrana plasmática de las células apoptóticas, y que ha sido descrito en un apartado anterior: La perdida de la asimetría de fosfolípidos. Esta provoca la exposición al exterior de la fosfatidilserina (PS). La inhibición de reconocimiento en ciertos sistemas mediante la adición de liposomas que contenían PS en su superficie sugirió una posible interacción de la PS en la superficie de la célula apoptótica con un receptor en el macrófagos. Esto ha sido confirmado por estudios posteriores (139).

Todos estos mecanismos intervienen en el aclaramiento de células apoptóticas. El funcionamiento de uno u otro depende de la especie y de la naturaleza, tanto de la célula apoptótica como del fagocito. En al caso de fagocitos "profesionales", existe además el interrogante de que estímulos quimiotácticos intervienen para atraer a dicha célula hacia el foco donde tiene lugar la apoptosis.

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