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Introducción general a la apoptosis
Caracterización molecular de la apoptosis
 

 

>> MODELO INICIAL: C.ELEGANS

>> FAMILIAS DE MOLÉCULAS IMPLICADAS EN APOPTOSIS

- Receptores de muerte:

>CD95 (APO-1/Fas)
>TNFR1
>DR3
>DR4 y DR5
>Proteínas de la familia Bcl-2
Bcl-2
Bcl-xL
Bax

>Miembros de la subfamilia BH3

- Proteínas de la familia de las caspasas

>> REGULACIÓN MOLECULAR DEL PROCESO DE APOPTOSIS

 

 

MODELO INICIAL: C.ELEGANS


Dentro del estudio del proceso de apoptosis que se ha venido realizando a lo largo de los últimos años, resultó determinante la descripción de los genes implicados en la maquinaria de apoptosis del nematodo caenorhabditis elegans (). C. elegans pertenece a un filo formado por:

"Gusanos de piel lisa, no segmentados, con un cuerpo alargado, cilíndrico y forma afilada en el extremo. Incluye formas libres y parásitas, ambas acuáticas y terrestres"

Es un organismo de aproximadamente 1mm de longitud, vive en el suelo sobre materia vegetal en descomposición, alimentándose de microorganismos. Su vida se prolonga a lo largo de 2-3 semanas durante las cuales se reproduce. El estudio de este nematodo fue iniciado en los años 60 por Sydney Brenner.

La ventaja que proporciona c. elegans como sistema experimental es que posee 959 células somáticas transparentes, que pueden ser estudiadas individualmente mediante microscopía, y 17800 genes diferentes que forman su mapa genético secuenciado íntegramente. Este organismo, a pesar de su simplicidad, desarrolla los procesos que en organismos superiores son motivo de estudio: embriogénesis, desarrollo, funcionamiento del sistema nervioso, comportamiento y envejecimiento. C. elegans representa el compromiso perfecto entre la simplicidad en su tratamiento y la complejidad de las funciones y los mecanismos que posee, regidas por genes que se han conservado a lo largo de la evolución hasta los mamíferos.

La apoptosis juega un importante papel en el desarrollo embrionario de c. elegans. A partir de los estudios que Horvitz inició en 1986 (Ellis, Cell 1996 mirar bibliografia Horvitz), se estableció el número y la localización de las células que morían por apoptosis durante el desarrollo y mediante el análisis de mutantes se describieron los genes implicados en este mecanismo. Estos genes se denominaron ced y se enumeraron desde el -1 al -10. Ced-3. -4 y -9 regulan la fase ejecutora de la apoptosis y el resto está implicado en los procesos de eliminación por fagocitosis de la célula apoptótica. Posteriormente se describió el gen EGL-1 que participa también en la regulación de la MCP (Hengertner, Cell 1998). El complejo ejecutor formado por ced-3, -4 y -9 representa la imagen más simplificada del programa apoptótico que se puede encontrar en células de mamíferos. Cada una de las proteínas expresadas a partir de ellos son equivalentes a las que, en organismos superiores, constituyen los pilares que soportan la red de señalización de la apoptosis. CED-3 es una proteasa equivalente a las caspasas de mamíferos, proteínas ejecutoras de la apoptosis que desmontan la maquinaria celular degradando un grupo seleccionado de proteínas. CED-3 se activa por homodimerización y para hacerlo posible, existe otra proteína CED-4 capaz de interaccionar con ella y también consigo misma. La unión de CED-3 a CED-4 y la posterior homodimerización de esta, traería consigo la activación de CED-3. CED-4 tiene también su homologo en mamíferos, Apaf-1, que se une a procaspasa-9 y facilita su activación. La tercera proteína de esta maquinaria es CED-9, la pieza reguladora, que se une a CED-4 y la inhabilita para mediar la activación de CED-3, al impedir su homodimerización (28). Su interacción con una proteína pro-apoptótica como es EGL-1 en c. elegans, la separa de CED-4 dejándola realizar su función activadora de la apoptosis (Hengertner, Cell 1998bis). En mamífero, esta proteína es equivalente a toda una familia con miembros tanto pro-apoptóticos como anti-apoptóticos que regulan el proceso de muerte celular. Las moléculas equivalentes entre los sistemas que se han mencionado anteriormente, presentan tal homología de secuencias que muestran que este sistema se ha mantenido totalmente conservado a lo largo de la evolución. Los componentes del sistema que parece que han sido de adquisición más recientes son los receptores de muertes, ya que ningún equivalente de ellos ha sido encontrado aún en c. elegans.

De esta forma, el estudio del nematodo c. elegans estableció las bases para la caracterización, que hoy día aún es incompleta, de la compleja red de procesos que culminan con la apoptosis celular y que a continuación se resumen.

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FAMILIAS DE MOLÉCULAS IMPLICADAS EN EL PROCESO DE APOPTOSIS

----------- RECEPTORES DE MUERTE

Las moléculas relacionadas con el proceso de apoptosis que se han mantenido a lo largo de la evolución, desde organismos como el c. elegans hasta los mamíferos, llevan a cabo un programa de apoptosis iniciado por señales que provienen del interior celular. Estas señales responden a eventos que comprometen el buen funcionamiento de la célula dentro del entorno donde está situada: perdida de contacto con las células que la rodean, estrés celular o señales contradictorias y simultaneas en cuanto a la puesta en marcha o no, de su ciclo de división. Ante esta situación, en que la célula es potencialmente peligrosa para el sistema donde se encuentra integrada, se pone en marcha la maquinaria de apoptosis y es eliminada. Este sistema señalizador no puede sostener el tipo de apoptosis llamado "instructivo" en el cual a una célula que no ha sufrido ninguno de los daños mencionados anteriormente, se le dirige activamente hacia la apoptosis ya que su eliminación es necesaria para llevar a cabo determinado proceso fisiológico. Los mamíferos han desarrollado mecanismos para llevar a cabo esta forma de apoptosis que es especialmente importante dentro del sistema inmune. En la apoptosis "instructiva" tienen un papel fundamental los llamados receptores de muerte, situados en la superficie de la célula, y que reciben la señal de ligandos de muerte específicos para cada uno de ellos. Los receptores pueden dar la señal directamente a las caspasas en pocos segundos disparando así el programa de apoptosis (54).

Los receptores de muerte pertenecen a la superfamilia del receptor de TNF (TNFR) cuyos miembros tienen en común un dominio extracelular rico en cisteina. Otro rasgo común a todas estas moléculas señalizadoras de apoptosis es la presencia de una secuencia situada en su dominio intracitoplasmático y que serviría para acoplar al receptor con el resto de la maquinaría apoptótica. Los receptores de muerte mejor caracterizados son los siguientes:

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• CD95 (APO-1/Fas)

Esta proteína fue identificada inicialmente mediante un Ac dirigido contra ella y que define un Ag presente en la superficie de células como linfocitos humanos B y T activados, algunas líneas tumorales de origen linfoide y otros tipos celulares como son los hepatocitos. El Ac contra CD95 se une a las células que lo expresan provocándoles apoptosis in vitro (109,130, 131). Por otra parte, inyectando in vivo Ac anti-CD95 a ratones nu/nu con xenotransplantes de tumores humanos, eliminaban estos por apoptosis de sus células (Trauth, Science 1994).

El gen que codifica para la proteína CD95 en humano se encuentra en la localización 10q23 (cromosoma 10) y consiste en una serie de 9 exones interrumpidos por 8 intrones. El dominio extracelular de la proteína está formado por tres subdominios ricos en cisteinas, codificados por los exones 2, 3 y 4, mientras que la zona intracitoplasmática, incluida la región reguladora llamada "death domain", se encuentra en el exón 9 (117).

El ligando fisiológico de CD95 se denomina CD95L y es una proteína perteneciente a la familia del TNF (tumor necrosis factor). CD95 se expresa de forma bastante general en los distintos tejidos. La proteína ha podido ser detectada en células epiteliales, fibroblastos, osteoblastos y ciertos tipos de endoteliales (117/8), además en ratón, el ARNm de la proteína se ha detectado abundantemente en timo, corazón hígado y ovario (117/10) . Por otra parte, CD95L se expresa predominantemente en células T y NK activadas, así como de forma constitutiva en los tejidos que gozan de "privilegio inmune". Este patrón de expresión de ambas moléculas demuestra que deben tener implicación en una serie importante de procesos fisiológicos relacionados con el sistema inmune.

Resulta importante a la hora de determinar el papel jugado por algunas moléculas, estudiar el efecto que tiene su pérdida de función en ratones "knockout". En el caso del par CD95/CD95L, existen ratones que portan las mutaciones homocigóticas lpr (lymphoproliferation) o gld (general lymphoproliferation disease), que se traducen por una perdida de función de los genes CD95 y CD95L respectivamente (). Estos ratones presentan una serie de alteraciones como son linfoadenopatías y esplenomegalia por acumulación de células de origen T CD4- CD8-, niveles elevados de autoAc y desordenes de carácter autoinmune e inflamatorios (481). En el caso de las moléculas CD95/CD95L, existe también un referente humano de la perdida de su función, ya que se ha descrito en una serie de niños una mutación con carácter heterocigótico en el gen que codifica CD95. Esta mutación da lugar a un fenotipo similar al de los ratones lpr y gld, incluyendo linfoadenopatías, esplenomegalia, hipergammaglobulinemia y, de forma variable, una serie de alteraciones autoinmunes (133/Fisher, Cell 1995). Estos datos, tanto en ratón como en humano, han resultado de ayuda a la hora de establecer una serie de procesos fisiológicos en los que la implicación de la apoptosis mediada por la pareja de moléculas CD95/CD95L está perfectamente demostrada.

Estos procesos son:

Modulación negativa de la respuesta inmune mediante la muerte por apoptosis de las células T activadas una vez realizada su función (133/Naga, Science 1995). De esta forma se evita su acumulación. También parece estar implicada en la delección de clones autorreactivos de linfocitos B.

Mecanismo efector de citotoxicidad por parte de linfocitos T y células NK. Se ha demostrado un papel importante de la apoptosis vía CD95 en la citotoxicidad mediada por células T y NK. Este mecanismo ocurre en unión al clásico, mediado por perforina /granzima B.

Existen órganos, como el ojo o testículos; cuya estructura no podría soportar los efectos de una respuesta inmune y su proceso inflamatorio asociado. Estos tejidos están aislados a estos procesos y se conocen como "sitios de privilegio inmune". Se pensaba que este "privilegio" se mantenía evitando la entrada de células activadas en ellos. Recientemente, se ha propuesto otro mecanismo de conservación del privilegio inmune. Las células activadas pueden entrar en estos tejidos pero, una vez allí, son eliminadas por apoptosis vía CD95 (133/Griffith, Science 1995). Esto se confirmó con el hallazgo de una expresión constitutiva de CD95L en el epitelio y endotelio de la cornea y el iris, en las células ciliares del ojo, así como en las células de Sertoli en el testículo, y con la observación de que, en ratones gld, se produce una inflamación masiva en la retina tras la infección con virus de herpes simple a diferencia de los ratones wild-type que no presentan apenas células inflamatorias.

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• TNFR1

El receptor 1 de TNF es una proteína de aproximadamente 55 kDa y se expresa en la mayoría de los tipos celulares. Esta proteína da nombre a la familia en que está integrada, por tanto comparte con CD95 los tres subdominios ricos en cisteinas situados en la zona extracelular. El ligando de TNFR1 es TNF, una citoquina producida principalmente por macrófagos activados y células T en respuesta a infección (Artículo revisión nuevo). A diferencia de la pareja formada por CD95/ CD95L, el par TNFR1/TNF es capaz de trasmitir a la célula dos tipos de señales muy distintas entre sí. Por una parte, la unión de TNF a su receptor TNFR1 activa a los factores de transcripción NFkB y AP-1 dando lugar a la inducción de genes de carácter proinflamatorio e inmunomodulador. Por otra parte, esta unión puede dar lugar también a una señal de apoptosis. La señalización de apoptosis por medio de TNFR1 es mucho más limitada que la mediada por CD95. En el caso de TNFR1, la unión de su ligando solo señaliza apoptosis en algunos tipos celulares y solo cuando la síntesis de proteínas ha sido bloqueada. De este hecho se deduce que debe existir en las células algún factor que bloquee las señales de apoptosis derivadas de TNFR1. La expresión de este factor estará probablemente controlada a través de NFkB y JNK/AP-1 (54bis).

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• DR3

El receptor DR3 (death receptor 3) es muy parecido en cuanto a su secuencia, a TNFR1. Cuando se une a su ligando Apo3L, da lugar también a una doble señal que puede llevar a la activación de NFkB o a la muerte por apoptosis de la célula. Las moléculas que median ambas vías de la señalización son también las mismas que en el caso de TNFR. En el único aspecto en que existen diferencias entre ambas rutas de señalización es la expresión, tanto de receptores como de ligandos. El mensajero de Apo3L se encuentra expresado de forma constitutiva en muchos tejidos, mientras que DR3 se encuentra presente principalmente en bazo, timo y sangre periférica y se induce por la activación en linfocitos T (259). De forma inversa, es el receptor de TNF el que se encuentra expresado de forma ubicua mientras que el ligando se expresa solo en linfocitos y macrófagos activados. Esta diferencia sugiere distintas funciones biológicas para ambas vías señalizadoras.

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• DR4 y DR5

DR4 y DR5 son receptores de muerte cuyo ligando llamado TRAIL o Apo2L es el que muestra mas similitud con CD95L aunque, a diferencia de estas molécula, su ARN mensajero se encuentra expresado de forma constitutiva en gran cantidad de tejidos y la expresión se eleva en linfocitos T se sangre periférica cuando estos son estimulados. La señal a través de Apo2L produce apoptosis en una gran variedad de líneas tumorales. Se ha descrito también en una subpoblación de células T maduras, un aumento de la apoptosis mediada por Apo2L al tratar estas con IL-2. Esto puede sugerir un posible papel de estos receptores en la delección periférica de los linfocitos T (54/Martinez lorenzo, Eur J Immunol in press). Otro posible papel de la apoptosis mediada por Apo2L es la eliminación de células infectadas por virus (54/Jeramias, Eur J Immunol 1998). La señal de apoptosis mediada por estos receptores puede ser regulada mediante una familia de receptores "decoy" (señuelos), DcRs, que protegen a la célula de la apoptosis provocada por la unión de TRAIL. Uno de los miembros de esta familia es DcR1 (TRID, TRAIL-R3 ó LIT) (54/17), una proteína ligada a la superficie celular por una unión glicosil fosfatidil-inositol (GFI), que se asemeja a la porción extracelular de DR4 pero sin poseer ningún dominio intracitoplasmático. DcR1 es capaz de unirse a TRAIL y su transfección en células sensibles a esta vía de señalización reduce notablemente la apoptosis mediada por esta señal (54/56). DcR2 (TRAIL-R4 ó TRUNDD) es también un receptor homologo a DR4 y DR5 con el dominio intracitoplasmático truncado. Se ha demostrado que la transfección con DcR2 inhibe la apoptosis mediada por TRAIL (54/58) de forma no activa, ya que la eliminación de su dominio interno no influye en su actividad inhibidora (54/57). Todos estos datos indican que, tanto DcR1 como DcR2 compiten con DR4 y DR5 por la unión de TRAIL, dificultando así que la señal de apoptosis sea transmitida a través de estos receptores.

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Proteínas de la familia Bcl-2

Un proceso como la apoptosis, que culmina con la muerte de las células y que se cuenta con casi la totalidad de la maquinaria para llevarse a cabo ya sintetizada, a falta solo de la señal que la ponga en marcha, necesita de mecanismos de regulación de gran exactitud y seguridad. Una de las vías de regulación de la apoptosis más importantes es llevada a cabo por una familia de proteínas que cuenta en la actualidad con al menos 15 miembros en mamíferos y otros tantos en virus, y que tiene como característica, la homología de todos sus miembros con Bcl-2 que fue la primera que se describió. Las moléculas de esta familia tienen su equivalente en el sistema de c. elegans. Una de sus proteínas encargadas de llevar a cabo el programa de apoptosis, CED-9, muestra gran similitud tanto estructural como funcional con Bcl-2 impidiendo la activación de CED-3, efectora de la apoptosis, por CED-4 (153).

La descripción del primer miembro conocido de la familia, Bcl-2, se realizó al estudiar el punto de corte en la translocación t(14:18), presente en el 85% de los linfomas foliculares de células B humanas (155). Esta translocación trasladaba un protoconcogen, al que se denominó bcl-2, desde su posición normal en 18q21 hasta el locus de la cadena pesada de la inmunología en 14q32. Esto colocaba a bcl-2 bajo las ordenes del promotor de la cadena pesada de inmunoglobulina, desregulando su transcripción y dando como resultado la sobreexpresión de Bcl-2 en las células de linfoma. A partir de la descripción de esta proteína, tuvieron lugar otras muchas descripciones de moléculas que guardaban homología con esta y que tenían carácter anti o pro-apoptótico. Lo que identifica a todas estas proteínas como miembros de una sola familia es la presencia en su estructura de al menos una de cuatro secuencias consecutivas descritas y que se numeran desde BH1 a BH4 (58). De estos dominios parece que BH3 está directamente relacionado con una función pro-apoptótica y el resto de ellos con una función anti-apoptótica. La estructura que presentan está también condicionada a la presencia de estos dominios. BH1, BH2 y BH3 forman una a-hélice cada uno de ellos y cuando están presentes en la misma moléculas, por ejemplo Bcl-x, pueden formar una hendidura hidrofóbica, en la cual podría encajar la a-hélice formada por el dominio BH3 si se encontrara en otra molécula de la familia orientado hacia el exterior (58/21). Este dato estructural explica el importante papel que tiene en el funcionamiento de estas moléculas las homo y heterodimerizaciones, que tienen lugar ente ellas y que pueden dar lugar a su activación o inactivación. De esta forma, se crearía un equilibrio entre ellas en el que sería de vital importancia sus cantidades relativas. La heterodimerización no es necesaria para la actividad de los miembros anti-apoptóticos de la familia y para los pro-apoptóticos del grupo Bax. Sin embargo, es muy importante para los miembros pro-apoptóticos del grupo BH3 que basan gran parte de su funcionamiento en la unión a las proteínas anti-apoptóticas alterando su actividad. Los miembros más estudiados y que poseen una relación con el sistema inmune mejor establecida son los que se exponen a continuación:

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• Bcl-2

Es la proteína prototipo de esta familia. Pesa 26 KDa y posee los cuatro dominios que la definen (BH1-BH4). Bcl-2 es una proteína integral de membrana y se encuentra en la cara citoplasmática de la membrana externa de la mitocondria, el retículo endoplásmico y la envuelta nuclear. Es en esas membranas, gracias a que puede formar una estructura similar a un poro, donde se desarrolla una de sus posibles funciones: modificar el flujo de moléculas o pequeñas proteínas a través de ellas, interviniendo en la estabilidad de orgánulos como la mitocondria ante la existencia de posibles daños. Su sobreexpresión puede evitar o al menos retrasar varias formas de muerte celular programada como las inducidas por retirada de factores de crecimiento, irradiación g, glucocorticoides y múltiples drogas quimioterápicas (153bis). En contraste, parece no influir en otros mecanismos de apoptosis como, por ejemplo, la señalización vía CD95 en la mayoría de los tipos celulares (58 o 42)0. A la hora de establecer el papel fisiológico realizado por Bcl-2, debe estudiarse el fenotipo que presenta el ratón knockout para el gen que lo codifica (58bis/54). El animal se desarrolla normalmente pero termina mostrando una exagerada apoptosis de linfocitos y melanocitos, así como lesiones neuronales e intestinales y una enfermedad renal terminal. Esto lleva a pensar que Bcl-2 no tiene un papel muy importante, o al menos tiene un papel redundante, en el desarrollo embrionario pero, ya después, interviene en la regulación de la apoptosis en linfocitos, neuronas y el resto de células y tejidos mencionados anteriormente.

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• Bcl-xL

Bcl-xL es una de las proteínas más estrechamente relacionada con Bcl-2, tanto en su estructura como en su función. Posee los cuatro dominios BH y su peso molecular es de 30 KDa. Su sobreexpresión puede mediar una resistencia significativa a la muerte celular por apoptosis dependiente de deprivación de factor de crecimiento. Se ha estudiado la expresión del ARNm de esta molécula y parece encontrarse en una gran variedad de tejidos entre los que destaca algunas poblaciones del sistema hematopoyético y el sistema nervioso central (288). Esta distribución preferencial puede sugerir algunos de los papeles fisiológicos que puede jugar la expresión de esta proteína. La expresión del mensajero de esta molécula en tejido neural adulto es alta y constitutiva y esto puede estar relacionado con la capacidad de este tejido de mantener la viabilidad celular postmitótica durante largos periodos de tiempo. Un dato que hace importante a la molécula Bcl-xL en el contexto de este trabajo es que, dentro de la ontogenia de los linfocitos B, Bcl-xL se expresa en dos momentos muy concretos: uno es el estadio pre-B y otro es durante la estancia de las células en los CG, justo al mismo tiempo en que se produce una "downregulation" de Bcl-2 (291'). Estos datos acompañados de experimentos en que se estudia el efecto de la sobreexpresión de Bcl-xL sobre la respuesta inmune a nivel de órganos linfoides secundarios revelan un importante papel de la proteína Bcl-xL en estos territorios aunque no se ha podido establecer aún su mecanismo de acción. El ratón knockout para este gen es inviable lo que demuestra su enorme importancia también el desarrollo embrionario (58/45).

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• Bax

Esta proteína es uno de los miembros pro-apoptóticos más importantes de la familia. Le da nombre a la subfamilia Bax, su peso molecular es de 21 KDa y posee los dominios BH1, BH2 y BH3 aunque son BH1 y BH2 los que guardan una estrecha homología con Bcl-2 (314). Bax esta ampliamente expresado en los distintos tejidos y su sobreexpresión acelera la muerte en respuesta a distintas señales. Lo que ha hecho recientemente a Bax objeto de estudio es su implicación en los fenómenos mitocondriales de la apoptosis y su capacidad de llevar a cabo una forma de muerte celular programada independiente de muchos de los mecanismos de regulación y ejecución de este proceso. Esto parece estar relacionado con su capacidad para interaccionar con los canales que controlan la permeabilidad y el flujo ionico en dicho orgánulo (157).

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Miembros de la subfamilia BH3

Esta subfamilia está compuesta solo por miembros proapoptóticos que, excepto por el dominio BH3, no muestran homología con Bcl-2. Para ejercer su actividad, estas proteínas pueden formar heterodímeros con miembros antiapoptóticos de la familia (58/19). Para ello, el dominio BH3 de los miembros de este grupo puede introducirse en el hueco hidrofóbico formado por la asociación de las regiones BH1, BH2 y BH3 de los miembros antiapoptóticos (58/21). Un ejemplo de la acción de esta familia de proteina es la ejercen dos de sus miembros Bid y Bik sobre la mitocondria, donde inducen la liberación de citocromo c y posterior apoptosis (Shimizu, PNAS, 2000).

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----------- PROTEINAS DE LA FAMILIA DE LAS CASPASAS

Dentro de la maquinaria que lleva a cabo el programa de apoptosis, los miembros ejecutores son una serie de proteasas englobadas bajo el nombre de caspasas. Este sistema ejecutor se ha mantenido a lo largo de la evolución y, tras su descripción en c. elegans, se encontró el equivalente en mamíferos gracias a la homología que presentaban ambas moléculas. Esta primera proteasa encontrada en mamífero se denominó ICE (interleukin-1b-converting enzime) o caspasa-1 (cisteina-aspartasa-1) y es precisamente uno de los pocos miembros de la familia al que no se le ha podido hallar relación directa con el proceso de apoptosis, sino más bien con el de la inflamación (55).

La familia de las caspasas en humanos está formada hasta el momento por 11 miembros descritos, y todos ellos tienen en común que se encuentran en forma de zimógeno o proenzima con una estructura bien definida: a)el dominio N-terminal es muy variable tanto en su secuencia como en su longitud y tiene funciones de regulación y activación, b) la región catalítica está formada por dos dominios, uno grande ("20 KDa) y otro pequeño ("10 KDa), que darán lugar a las dos subunidades del enzima una vez activada. Las caspasas se dividen en dos grupos según la longitud de su región reguladora N-terminal o prodominio. Las caspasas con prodominio largo como son la -1,-2, -4, -5, -8, y -10 parecen estar involucradas en funciones de regulación de la activación de la cascada. Ejemplos bien conocidos de este grupo son las procaspasas -8 y -10 que contienen en sus largos prodominios repeticiones de una secuencia de interacción proteina-proteina llamada dominio efector de muerte o DED (death effector domain) y las procaspasas -1, -2, -4, -5 y -9, que contienen dominios de reclutamiento de caspasas o CARDs (caspase recruitment domains). La presencia en su estructura de estas secuencias unido a su localización cercana a la membrana plasmática hacen posible su reclutamiento hacia el complejo formado en torno a receptores de superficie señalizadores de apoptosis como CD95 y TNF, activándose allí y dando lugar al comienzo de la cascada de proteolisis. Por esta situación dentro del proceso se las conoce como caspasas iniciadoras. El otro grupo está compuesto por las caspasas con prodominio corto como son las caspasas -3, -6 y -7. Estas parecen estar situadas "downstream" en la cadena y se ha demostrado in vitro que son activadas por alguna de las caspasas iniciadoras (25). Los estudios realizados sugieren que estas caspasas llamadas efectoras son las que actúan al final de la cascada sobre los componentes celulares, proteolizándolos. Las caspasas realizan su función enzimática de forma específica y eficaz. Cortan una cisteina precedida por un aspártico, cuando existe en el sustrato una secuencia de reconocimiento compuesta de cuatro aminoácidos y que varía significativamente entre las diferentes caspasas. Además, es necesario que la proteína sustrato posea también una estructura terciaria que le permita ser reconocida por las caspasas. A la hora de estudiar el papel de las caspasas en los distintos sistemas, se utilizan péptidos inhibidores sintéticos, que compiten con los sustratos fisiológicos por el sitio activo del enzima. Estos péptidos pueden ser específicos para bloquear la acción de una o varias caspasas o generales. También existe variabilidad en cuanto a la reversibilidad de su efecto (48).

El mecanismo de acción de las caspasas tiene importancia a la hora de explicar tanto su papel dentro de la apoptosis como su activación. Todas las caspasas se activan por proteolisis y cumplen todas las condiciones para que esta activación sea llevada a cabo por otras caspasas. Una de estas moléculas activa a la otra cortando entre sus dominios. De esta forma, el prodominio se pierde y la enzima activa queda formada por un heterodímero compuesto por la subunidad grande y la subunidad pequeña. Ambas subunidades aportan al sitio activo residuos encargados tanto del reconocimiento de sustrato como de la catálisis. A la hora de actuar, las caspasas lo hacen en forma de tetrámero, dos unidades enzimáticas que se unen entre sí manteniendo ambos sitios activos independientes (55/5 o 6). Este proceso de activación puede permitir a las caspasas realizar su función con un efecto cascada que se va amplificando a si mismo desde que se da la señal de inicio. En cuanto a esto, se ha especulado mucho sobre como tiene lugar la señal que determina la primera autocatálisis activadora que disparará el sistema. Este sería además uno de los puntos donde podría establecerse una regulación del sistema. Existe una hipótesis basada en la observación de que la sobreexpresión de determinadas procaspasas en la célula hace que estas se agrupen y se autoactiven. Esto sugiere que las caspasas iniciadoras podrían encontrarse como monómeros a bajas concentraciones y que la molécula adaptadora unida al receptor de muerte serviría para unirlas propiciando su autocatálisis. Existe también un modelo llamado "de autocatálisis facilitada" que postula que las caspasas se encuentran en la célula formando complejos o con una conformación tal, que previene su autocatálisis. Un cofactor actuaría facilitando la activación, bien cambiando la conformación de las misma, o bien liberando un inhibidor del complejo formado, de forma que se permitiese la autocatálisis de la proteína y el comienzo de la señal apoptótica (55).

En cuanto a los sustratos celulares sobre los que actúan las caspasas, estos son un número determinado de proteínas que son cortadas de manera coordinada con la finalidad de hacerles perder su función o modificársela, de tal manera, que la organización celular resulte desmantelada. La ruptura de sustratos por parte de las caspasas produce estos efectos en el proceso general:

-Llevan a cabo una degradación de moléculas implicadas en proteger a la célula del proceso de apoptosis como es el caso de ICAD/DFF45, la molécula que mantiene inhibida a CAD, la nucleasa responsable de la degradación del DNA durante la apoptosis (70). Otras moléculas protectoras de la célula y que son degradadas por caspasas son alguno de los miembros anti-apoptóticos de la familia Bcl-2 (239). En el caso de estas proteínas, la proteolisis libera un fragmento que tiene poder pro-apoptótico por si mismo. De esta forma, las caspasas realizan una alimentación positiva de su propio efecto.

-Degradan también moléculas implicadas directamente en la estructura celular como son la quinasa de adhesión focal o FAK (focal adhesion kinase) y la quinasa 2 activada por p21, modificando su actividad (91). En otras ocasiones, como en el caso de la gelsolina, la rotura por caspasa le hace perder la región reguladora pasando a expresarse de forma constitutiva (239bis).

-Otras proteínas degradadas por las caspasas son algunas de las relacionadas con la reparación en el ADN y con los procesos de replicación y transcripción del ADN (DNA-PKCS) o la poli (ADP-ribosa) polimerasa (PARP). En este último caso, no está aún claro que objetivo persigue la ruptura de estos sustratos dentro del programa general de apoptosis (235).

Ante el gran número de caspasas que existen, aparentemente con funciones intercambiables, se plantea la cuestión de si existe una función redundante te todas ellas o si lo que ocurre, es que su actividad es específica de cada tejido. Experimentos con ratones knockout para varios miembros de las caspasas proporcionan una respuesta a esta pregunta, además de ilustrar sobre el papel fisiológico de estas proteasas (423). Estos estudios concluyen que existe una activación de las caspasas dependiente tanto del tejido como del estímulo desencadenante de la apoptosis. Por último, la actividad de las caspasas va acompañada de la acción de sus inhibidores al igual que ocurre con otros sistemas proteolíticos. Se han identificado varios de estos inhibidores en virus. Los mejor estudiados son CrmA y p35. CrmA (cytokine response modifier A) es una molécula producida por el virus cowpox. Inhibe potencialmente las caspasas -1 y -8, y bloquea la apoptosis causada por TNF, CD95, la provocada por retirada de suero u otros factores de crecimiento, así como la que se origina tras romper las uniones de la células con la matriz extracelular. p35 es una proteína de baculovirus que bloquea principalmente la apoptosis producida por infección viral. Aunque estos inhibidores han sido encontrados solo en varios virus, existe una familia de proteínas inhibidoras de apoptosis (IAPs), alguno de cuyos componentes se han descrito ya en humanos (99). Se ha descrito in vitro una potente activación selectiva de caspasa-3 y-7 por parte de IAP, aunque el mecanismo de esta inhibición continua sin aclararse.

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REGULACIÓN MOLECULAR DEL PROCESO DE APOPTOSIS

Hasta este momento se ha podido ver la descripción de los componentes más importantes de la maquinaria de apoptosis en mamífero, así como un pequeño esbozo de su función dentro del sistema. Dentro del proceso de apoptosis, todos estos elementos se encuentran coordinados entre sí, tanto física como funcionalmente y aportan al sistema global una gran variedad tanto de rutas de iniciación en respuesta a muy diferentes estímulos, como de puntos de regulación. En la vía señalizadora de apoptosis que, más que una forma lineal, presenta una estructura reticular muy ramificada en sus inicios y que después va confluyendo hacia rutas comunes para terminar en una o unas pocas, tienen especial importancia esos puntos de regulación. Existen sobre todo algunos, situados al final dentro de la red, donde se deciden acciones tan drásticas para la integridad celular que constituyen auténticos puntos de no retorno.

A la hora de entender la interacción existente entre la señal de apoptosis y la puesta en marcha de la cascada de proteolisis mediada por caspasa, es necesario conocer la existencia de una serie de proteínas, los adaptadores. Entre estos adaptadores se encuentran FADD, TRADD y Apaf-1. FADD (Mort-1) (252), es una proteína que sirve de puente entre CD95 y la procaspasa-8. Para ello posee dos regiones de unión que son las que distinguen a las moléculas adaptadoras. Por una parte, un dominio DD (death domain) por el cual se une a una región homologa presente en la región intracitoplasmática de CD95, y por la otra, un dominio DED (death effectot domain), ejemplo partículas del dominio CARD (caspase recruitment domain) de unión homotípica que poseen tanto las moléculas adaptadoras como las caspasas de prodominio largo y, que en este caso, le sirve para unirse a procaspasa-8 (136). La perdida de FADD, estudiada mediante ratones knockout, es letal en la etapa embrionaria, lo que muestra que FADD debe tener otras funciones de señalización críticas, además de servir de puente entre CD95 y procaspasa-8 (54/33). TRADD es el adaptador que se une mediante un dominio DD a la región intracitoplasmática de los receptores de superficie TNFR1 y DR3, y actúa como plataforma de emisión de varias señales, mediante su unión con otros adaptadores. La unión de TRADD con FADD, también por la región DD, media la activación de procaspasa-8 como se vió anteriormente. Poe otra parte, TRADD puede unirse también al complejo ofrmado por RIP (que posee también dominio DD) y TRAF2, dirigiendo la señal hacia la activación de NF-kb (127). Por último, la proteína Apaf-1, homologa de la proteína de c. elegans.CED-4, actua como molécula adaptadora a nivel de mitocondria, uniendose a procaspasa-9 a través de un dominio CARD que posee en su extremo N-terminal. Apaf-1 tiene la capacidad de homodimerizarse, facilitando la agregación de la procaspasa como se vera a continuación. El papel de Apaf-1 es muy importante, como se demuestra en el efecto que su ausencia tiene en el ratón knockout, que muere durante la embriogénesis con graves alteraciones craneofaciales, sobrecrecimiento del cerebro y malformaciones en el ojo (5).

El inicio de la señal de apoptosis puede encontrarse tanto fuera de la célula, en los receptores de superficie, como dentro de ella respondiendo a estímulos de estrés celular a nivel de mitocondria o a disfunciones dentro del ciclo celular. Los receptores en la superficie de la célula como CD95 y TNFR1 dan comienzo a la señal de apoptosis realizando un reclutamiento de procaspasa-8 (54bis). Para ello, interviene la molécula adaptadora FADD que en el caso de CD95 se une de forma directa y en el de TNFR1 lo hace a través de la molécula intermedia TRADD (TNFR-associated death domain). La proteína FADD contiene un dominio DED que recluta varia subunidades de procaspasa-8. TNFR1 puede dar lugar también a la activación de otras procaspasas mediante la unión de otras moléculas adaptadoras como son RAIDD y RIP2 que contienen regiones CARD, el otro dominio de interacción proteina-proteina que sirve para el reclutamiento de procaspasas. A partir de esta activación se desencadena el proceso. Otro punto de inicio de la señal de apoptosis es la mitocondria (56). Existe una molécula, Apaf-1, homologa en mamíferos de la proteína CED-4 de c. elegans, que puede unir procaspasa-9 mediante la interacción de sus regiones CARDs. Apaf-1 posee además otra región capaz de mediar su homodimerización y por tanto la unión de las procaspasas-9, lo que lleva a su autocatálisis y posterior activación. En todos estos sistemas, el complejo formado por los receptores, los adaptadores y la procaspasa se denomina apoptosoma, y es la formación de este complejo lo que da lugar a la activación de la procaspasa. En el caso de Aaf-1, para llevar a cabo el proceso de formación de este apoptosoma es necesaria la presencia de ATP y de citocromo c, una molécula de pequeño tamaño liberada por la mitocondria. De esta forma, la liberación de citocromo c por parte de la mitocondria puede mediar la activación de la procaspasa-9. Esta señal de activación puede venir de la mitocondria en si misma como respuesta a distintas formas de estrés celular o también, puede formar parte de un bucle de amplificación de la señal mediada por receptores de superficie en la que interviene la mitocondria. En este bucle de amplificación interviene una proteína pro-apoptótica de la familia Bcl-2, Bid, que es procesada por caspasa-8 dividiéndose en dos fragmentos (44). Uno de ellos, el C-terminal, actúa sobre la mitocondria haciéndole liberar al exterior citocromo c, que activa el apoptosoma formado por Apaf-1 y procaspasa-9 llevándole a su procesamiento. De esta forma, en apoptosis mediada por receptor de muerte en las que existen pocos precursores de caspasa-8, la señal se amplifica mediante este sistema (2). Este punto de la red de señalización es susceptible a regulación por miembros anti-apoptóticos de la familia Bcl-2, que actuarían inhibiendo el transporte de citocromo c al exterior y estabilizando la membrana mitocondrial. Por eso la apoptosis mediada por receptor no se afecta por proteínas de la familia Bcl-2 excepto en los casos en que en esta ruta tiene gran peso la amplificación llevada a cabo por Bid en la mitocondria.

En cuanto a la señal de muerte que parte exclusivamente de la mitocondria, puede responder a una gran variedad de estímulos que impliquen estrés celular como son algunas drogas, radiaciones, agentes oxidantes, sobrecarga de Ca++, etc. Algunos de estos estímulos actúan directamente sobre la mitocondria y otros lo hacen a través de moléculas mediadoras como son las ceramidas, segundos mensajeros en la señalización de apoptosis y Bax, un miembro pro-apoptótico de la familia Bcl-2 muy importante en la apoptosis mediada por mitocondria (157bis). Los efectos de estas señales en la mitocondria se traducen en una serie de alteraciones en el buen funcionamiento del orgánulo. Se produce una liberación de citocromo c, ruptura de la cadena de transporte de electrones, liberación de iones superoxido y una hiperpolarización de la membrana interna que puede terminar con una expansión de la matriz y ruptura de la membrana externa de la mitocondria. Otros efectos sobre la mitocondria son la inducción del poro mitocondrial que quedaría permanentemente abierto, permitiendo la entrada de agua y solutos en la matriz con el consiguiente choque osmótico, y la liberación del factor inductor de apoptosis (AIF), que se ha demostrado que procesa procaspasa-3 in vitro (363). También la activación de Bax que puede formar, como otros miembros de la familia Bcl-2, un canal en la membrana de la mitocondria que en su caso, en lugar de estabilizarla como ocurre con los miembros anti-apoptóticos de la familia, haría lo contrario (321 o 362).

Por último, existen señales de apoptosis que tienen su inicio en el núcleo y esto es debido a que, en el contexto de un organismo pluricelular, una célula que ha adquirido por daños en el ADN un carácter neoplásico debe ser eliminada por apoptosis, ya que la desaparición de una célula no supone ningún perjuicio al organismo y en cambio su transformación si (57bis). Existen en la célula mecanismos capaces de detectar daños en el ADN y discriminar entre las dos posibles respuestas celulares a estos daños. La reparación, que puede ser útil en el caso de células que se van a diferenciar de forma inminente perdiendo su capacidad mitótica (ej: células epiteliales), la apoptosis o la detención de la célula en los estadios G1 y G2 del ciclo, lo cual es una forma de muerte ya que la célula queda genéticamente inhabilitada de manera irreversible. Las respuestas celulares a daños genéticos están mediadas por quinasas, de las que cabe destacar dos: ATM y la quinasa dependiente de ADN, DNA-PK. Ambas dirigen una serie de respuestas entre las que se encuentran activación del ciclo, detención del crecimiento celular, reparación y apoptosis. ATM y posiblemente DNA-PK actúan sobre el factor de transcripción p53 (). Este factor se encuentra normalmente a bajos niveles ya que es degradado por la proteína Mdm-2. El daño en el ADN induce fosforilación de p53 o Mdm-2, en el caso de Mdm-2 posiblemente por DNA-PK (). La fosforilación inhibe la interacción de ambas proteínas y por tanto p53 se estabiliza, incrementando su expresión y activándose. La activación de p53 puede dar lugar a dos respuestas:

Detención en el ciclo celular de forma irreversible mediante la inducción de p21, un inhibidor de la quinasa dependiente de ciclina (Cdk) ().

Apoptosis mediante un mecanismo que aun permanece sin determinar pero en el que parece que influye la activación de genes como el de Bax () y otras moléculas. Se han podido comprobar también otros mecanismos como transrepresión de genes anti-apoptóticos () y otros mecanismos no transcripcionales ().

Esta es la visión general de la red de eventos que rigen la apoptosis. Existen dentro de toda esta compleja red numerosos procesos aún por determinar, relaciones por establecer y mecanismos por entender dentro de un programa encaminado por igual a asegurar la vida de la célula y a procurar su muerte rápida y efectiva.

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